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Metronómica con bajas dosis de quimioterapia aumenta el CD95-dependiente efecto antiangiogénico de la trombospondina Péptido ABT-510: Una Estrategia de Complementación antiangiogénico Ronald Yap 1. Dorina Veliceasa 1. Urbana Emmenegger 2. Robert S. Kerbel 2. Laura M. McKay 3. Jack Henkin 3 y Olga V. Volpert 1 autores Afiliaciones: 1 Departamento de Urología de la Universidad de Northwestern Feinberg School of Medicine, Chicago, Illinois 2 Molecular e Investigación de Biología celular, Sunnybrook y de las mujeres de la universidad de Ciencias de la Salud Centro, Toronto, Ontario, Canadá y 3 Laboratorios Abbott, Abbott park, Illinois Las solicitudes de separatas: Olga V. Volpert, Departamento de Urología de la Universidad de Northwestern Feinberg School of Medicine, 303 Avenida East Chicago, Investigación Esperadnos Edificio Ste16-761, Chicago, IL 60611. Teléfono: 312-503-5934 Fax: 312 -908-7275 E-mail: olgavolpnorthwestern. edu. Resumen angiogénesis bloqueo es un enfoque prometedor en la terapia del cáncer. inhibidores naturales de la angiogénesis y derivados inducen señales mediadas por el receptor, que a menudo dan como resultado la muerte de las células endoteliales. quimioterapia de dosis baja, dada a intervalos regulares cortos y sin cortes prolongados (quimioterapia metronómica), también apunta a la angiogénesis por la obliteración células endoteliales en proliferación de células endoteliales y precursores circulantes. ABT-510, un derivado de péptido de la trombospondina, mata a las células endoteliales mediante el aumento de CD95L, un ligando para el receptor de muerte CD95. Sin embargo, la expresión de CD95 en sí no se ve afectada por ABT-510 y limita su eficacia. Hemos encontrado que múltiples agentes de quimioterapia, ciclofosfamida (Cytoxan), cisplatino y docetaxel, inducida por CD95 endotelial in vitro e in vivo en dosis bajas que no se pudieron matar las células endoteliales (docetaxel Cytoxan). Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que algunos de estos agentes podrían complementarse entre sí y juntos bloquear la angiogénesis con la máxima eficacia. Como prueba de principio, hemos diseñado un cóctel que combina antiangiogénico ABT-510 con Cytoxan o cisplatino. Ciclofosfamida y cisplatino aumentaron sinérgicamente en la apoptosis de células endoteliales in vivo y angiosuppression por ABT-510. Esta sinergia requiere CD95, ya que era reversible con el receptor CD95 señuelo. En un modelo de ratón, ABT-510 y Cytoxan, aplicado junto a dosis bajas, actuó en sinergia para retrasar tumor tomar, para estabilizar el crecimiento de los tumores establecidos, y que causa un retraso progresión a largo plazo de carcinoma de próstata PC-3. Estos efectos antitumorales fueron acompañadas de grandes disminuciones en la densidad microvascular y aumentos concomitantes de la CD95 vascular, CD95L, y la apoptosis. Por lo tanto, nuestro estudio muestra un diseño de la complementación de un tratamiento óptimo del cáncer con el péptido antiangiogénico y una quimioterapia metronómica. Trombospondina-1 es un agente antiangiogénico conocido (1). Su mecanismo de acción y la relación estructura-función se han analizado en profundidad considerable, dando como resultado el descubrimiento de un heptapéptido activo mínimo en el que la actividad antiangiogénica es mucho mayor por l - isoleucina a la sustitución - isoleucina d (2). ABT-526 y ABT-510 son versiones de este péptido mínimo modificado con mayores potencias (3) y un mejor aclaramiento ABT-510 está actualmente en evaluación en ensayos clínicos fase II (4). Trombospondina-1 también se ha identificado como un mediador derivado del hospedador de la acción antiangiogénica de una dosis baja de quimioterapia metronómica (5. 6). Trombospondina-1 y ABT-510 acto mediante la inducción de apoptosis de células endoteliales en algunos casos a través de CD36 de la superficie celular del receptor (7. 8). señal proapoptótico provocada por trombospondina-1 genera CD95L, un ligando para el receptor de muerte CD95 (9). Sin embargo, la expresión de CD95 en células endoteliales vasculares es independiente de trombospondina-1 Por lo tanto, CD95 accesible limita la tasa de apoptosis y antiangiogénesis debido a trombospondina-1 y por lo tanto determina, al menos en parte, la eficacia de los tratamientos de cáncer basados ​​en la trombospondina-1. agentes que buscan mejorar la eficacia de ABT-510, que se convirtió a los medicamentos quimioterapéuticos convencionales. quimioterapia metronómica (bajas dosis de quimioterapia administrada a intervalos regulares cerca sin cortes prolongados libres de drogas) proporciona una manera para inhibir la angiogénesis tumoral por dirigirse a las células endoteliales en proliferación en los vasos sanguíneos del tumor y la circulación de precursores de células endoteliales (CEP) que están más adelante integrado en tumor vasculatura (10 12). terapia Metronomic tiene menor toxicidad en comparación con la dosis máxima tolerada pulsátil quimioterapia (MTD) y por lo tanto disminuye o elimina la necesidad de los factores de crecimiento para acelerar la recuperación de la mielosupresión. Por otra parte, a pesar del uso de dosis acumulativas menores, el enfoque metronómica veces muestra resultados superiores en la prolongación de los tiempos de supervivencia en comparación con los regímenes de MTD convencionales, en modelos preclínicos (13. 14). El uso concomitante de la quimioterapia metronómica y fármacos antiangiogénicos, las terapias dirigidas, o vacunas antitumorales es una atractiva posibilidad de tratamiento de combinación como tales combinaciones pueden estar asociados con toxicidad reducida y por lo tanto mejorar la calidad de vida (revisado en ref. 12). Un agente de quimioterapia, adriamicina, utilizado a baja dosificación metronómica de tipo, se ha demostrado que aumenta la CD95 (15) y para aumentar la muerte celular por ABT-510 en células endoteliales cultivadas y en la remodelación de la vasculatura in vivo (16). El objetivo fue determinar si este efecto complementario se limita a adriamicina solo, o, por el contrario, típico de múltiples agentes de quimioterapia. Hemos sido capaces de demostrar que otros tres compuestos, ciclofosfamida (Cytoxan), cisplatino y docetaxel (Taxotere), cuando se aplica a dosis bajas no inducir a las células endoteliales o apoptosis de las células tumorales, pero aumentó CD95 endotelial en cultivo e in vivo con eficacia variable ( docetaxel Cytoxan). Se encontró que Cytoxan metronómica y cisplatino aumentaron sinérgicamente angiosuppression y la apoptosis de las células endoteliales por ABT-510 in vivo. El uso de un anticuerpo monoclonal y receptor señuelo Fas-Fc soluble in vivo. mostramos que antiangiogénico y la apoptosis de las células endoteliales por la combinación de ABT-510 / Cytoxan se basó en la cascada de muerte CD95. En un modelo de ratón de la terapia de tumores, ABT-510 y Cytoxan también actuó en sinergia, lo que retrasa la progresión del tumor, la reducción de la densidad microvascular tumoral, y causando apoptosis de células endoteliales. La búsqueda para los agentes, que aumentan CD95 endotelial, puede rendir aún más potentes combinaciones de la quimioterapia metronómica de baja toxicidad y no tóxico ABT-510, lo que podría dar lugar a retrasos prolongados en la progresión del tumor, mientras que el mantenimiento de una mayor calidad de vida para los pacientes de cáncer. Materiales y Métodos Células y reactivos. células endoteliales humanas (Cambrex, Walkersville, MD) se cultivaron en medio MCDB (Sigma, St. Louis, MO), 5 de suero bovino fetal, y los suplementos (Cambrex). las células PC-3 (American Type Culture Collection, Manassas, VA) se cultivaron en RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Island, NY), 10 FCS, y 1 de penicilina / estreptomicina (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). dicloruro de cisplatino diamina (cisplatino) y Cytoxan fueron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). 4-hidroperoxi-Cytoxan fue un regalo del Prof. S. Ludeman (Universidad de Duke, Carolina del Norte). Docetaxel fue generosamente proporcionada por Aventis (Bridgewater, NJ). Análisis del ciclo celular. Las células (1 10 5 por pocillo en placas de cultivo tisular de seis pocillos gelatinizados) obtenidas a 50 confluencia se trataron 48 horas con 4-hidroperoxi-Cytoxan, CP, o docetaxel en medio de crecimiento, se recogieron por breve tripsinización, se lavaron y se fijaron en 70 etanol (1 hora). Las muestras se incubaron 45 minutos a 37ºC con yoduro de propidio y RNasa y se analizaron por citometría de flujo en un citómetro FACScan (BD Biosciences, Rockville, MD) utilizando CellQuest (BD Biosciences) y ModFit LT (Verity, Topsham, ME) software. La apoptosis se evaluó como células en sub-G 1 fase. Evaluación de la expresión de CD95. células tratadas mismo modo se recogieron por tripsinización en 3 mmol / L EDTA, se lavaron, se incubaron 30 minutos a 4ºC con anticuerpos de control de CD95 o de isotipo anti-humano de ratón (1 g / ml PharMingen, San Diego, CA) seguido por anti-conejo conjugado con FITC - mouse IgG (1:50 DAKO, Fort Collins, CO) y se analizaron mediante clasificación de células activadas por fluorescencia. Matrigel enchufe ensayo de angiogénesis. C57BL / 6 ratones fueron inyectados por encima del esternón (s. c.) con 0,4 ml de Matrigel (BD Biosciences) que contiene 100 ng ml / factor de crecimiento endotelial vascular y 69 unidades / mL de heparina (17) y distribuidos aleatoriamente en grupos de tratamiento de cinco. Los tratamientos fueron 1 mg / kg / d ABT-510 o 0,1 ml de solución salina vehículo i. p. Cytoxan (2 y 20 mg / kg / d) en agua (oral), cisplatino potable (0,4 y 4 mg / kg / 3 días, i. v.), ABT-510 Cytoxan, y cisplatino ABT (para más detalles, véase la figura de leyendas). Después de 7 a 10 días, los tapones se retiraron, se congelaron-SNAP, y se seccionaron para análisis. modelos de terapia de tumores de ratón. 6 ratones C57BL / (de 4 a 6 semanas de edad, hembras) fueron inyectados con células de carcinoma de pulmón de Lewis (10 6) en los flancos derecho, s. c. Se inyectaron células PC-3 (1 o 2 10 6) en el flanco derecho de ratones desnudos macho de 4 a 6 semanas de edad (nu / nu. de Harlan, Indianapolis, IN Jackson Labs, Bar Harbor, ME o Taconic, Germantown, NY). Los ratones se asignaron al azar en grupos de cinco y se trataron con solución salina vehículo (0,1 ml / d, ip), ABT-510 (1 o 60 mg / kg / d), Cytoxan (2 o 20 mg / kg / d, oral), o ABT-510 Cytoxan. Los tumores se midieron cada 2 días o semanalmente y los volúmenes calculados como V 0.5 (ancho longitud 2). La duración del ensayo fue de 16 días para el carcinoma de pulmón de Lewis, 35 días o 21 semanas para PC-3. En un estudio prolongado, ABT-510 se usó a 60 mg / kg, 5 de 7 días a la semana y cytoxan a 20 mg / kg. La detección de la densidad de los microvasos y la apoptosis. Tumor o secciones de Matrigel (5 m) se incubaron con anticuerpo CD31 de rata anti-ratón (PharMingen, San Diego, Ca), seguido de anticuerpo de burro anti-rata conjugado con rodamina (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). La apoptosis se detectó mediante in situ terminal de desoxinucleotidil transferasemediated fin de etiquetado nick con ApopTag FITC Kit (Chemicon, Temecula, CA). Las imágenes digitales fueron obtenidas por microscopía confocal (Zeiss LSM510) y cuantificados para la densidad microvascular y la apoptosis con el software ImageJ (10, 40 campos por sección). Análisis estadístico y matemático. Los resultados se evaluaron utilizando la prueba t pareadas Estudiantes (SigmaPlot). La diferencia fue considerada significativa para P 1.0. Por último, la ecuación por Chou y Talalay (19), D D m (E / 1 E) 1 / m. se utilizó para determinar la concentración esperada para los compuestos individuales, que fueron utilizados posteriormente para calcular el producto fraccional de Webb. Resultados agentes de quimioterapia en múltiples dosis baja inducida por CD95 endotelial in vitro. Buscando terapias capaces de sinergia con ABT-510, hemos probado tres agentes de quimioterapia distinta en sus mecanismos de matar las células cancerosas: Cytoxan, un agente alquilante, un ADN de agente que daña, cisplatino y docetaxel, que causa la estabilización de los microtúbulos y por lo tanto conduce a detención mitótica y apoptosis. Sorprendentemente, los tres compuestos indujeron presentación CD95 por las células endoteliales en reposo in vitro aunque con eficacia variable (Fig. 1A). Cytoxan indujo eficazmente CD95 en 5 nmol / L. Por otra parte, la apoptosis de células endoteliales por Cytoxan se hizo detectable sólo a dosis superiores a 10 nmol / L. Curiosamente, Cytoxan induce simultáneamente presentación CD95 y la apoptosis (hasta 60) en las células de cáncer de próstata PC-3 a 12 nmol / L (datos no mostrados). El cisplatino aumentó significativamente CD95 en las células endoteliales, pero no en las células PC-3 en 4-6 nmol / L. A esta dosis de cisplatino, la apoptosis de células endoteliales se mantuvo similar al control sin tratar (3). Docetaxel causó un aumento modesto CD95 en las células endoteliales quiescentes pero sólo a dosis donde apoptosis ya llegó a ser prominente. múltiples agentes de quimioterapia inducen la expresión de CD95. A . cultivos de células endoteliales (HUVEC) fueron tratados ingenio concentraciones crecientes de Cytoxan (CTX, 4-OHC, izquierda), cisplatino (CDDP, centro) y docetaxel (DTX, derecha). B, in vivo de inducción de la expresión de CD95 por Cytoxan y cisplatino. Los ratones recibieron tapones de Matrigel subcutáneos que contienen una mezcla de VEGF y heparina para inducir la angiogénesis y tratado durante 7 días con vehículo de control, 2 mg / kg Cytoxan o 0,4 mg / kg de cisplatino. Los tapones se congelaron, se seccionaron, y se tiñeron para el marcador endotelial CD31 (rojo) y CD95 (azul). Nota aumento de CD95 en presencia de Cytoxan o cisplatino. C. expresión de CD95 in vivo se cuantificó usando software LaserPix de Bio-Rad (Hercules, CA). D. HMVECs fueron tratados con concentraciones crecientes de ABT-510 solos o ganar combinación con concentraciones fijas 4-hidroperoxi-Cytoxan (4-OHC). Se generaron curvas de dosis / respuesta. Tenga en cuenta el cambio de las curvas a la izquierda en dosis más altas 4-hidroperoxi-Cytoxan, indicativo de los más bajos valores de CI50. Tanto Cytoxan y cisplatino presentación mejorada CD95 por la remodelación microvasculatura in vivo. En ratones con s. c. tapones de Matrigel que contienen vascular mezcla del factor de crecimiento endotelial / heparina para inducir la angiogénesis, tratamientos diarios con 2 mg / kg Cytoxan o con 0,4 mg / kg de cisplatino cada 3 días aumentaron significativamente el número de estructuras endoteliales CD95-positivo (capilares) detectados por inmunofluorescencia situ (Fig. 1B). El análisis cuantitativo reveló aumentos estadísticamente significativos en la endotelial CD95 en ratones tratados con cisplatino y Cytoxan (de 4 a 6 veces, los datos P no mostrados). quimioterapia de dosis baja mejora la actividad ABT-510 mediante el aumento de la apoptosis de células endoteliales CD95-dependiente. A continuación, prueba Cytoxan y cisplatino a dosis bajas metronómicos para la capacidad de bloquear la angiogénesis y para inducir la apoptosis de células endoteliales solo o en combinación con antiangiogénico ABT-510. Debido a que el ABT-510 provoca la muerte de las células endoteliales a través de un mecanismo dependiente de CD95, que esperábamos que cooperan con los agentes que mejoran la presentación de CD95. De hecho, tanto la apoptosis de las células endoteliales 4-hidroperoxi-Cytoxan y cisplatino reforzada por ABT-510 in vitro (Fig. 1D datos no mostrados). En 1 nmol / L, 4-hidroperoxi-Cytoxan y cisplatino alterado ni presentación CD95 de las células endoteliales ni ED 50 de ABT-510 (30 nmol / L). Sin embargo, en presencia de 5 nmol / L 4-hidroperoxi-Cytoxan o cisplatino, ABT-510 ED 50 valor se redujo a 1 y 3 nmol / L, respectivamente. Para medir la densidad microvascular y endoteliales apoptosis de las células in vivo. utilizamos tapones de Matrigel implantado en ratones tratados con ABT-510 y / o Cytoxan o cisplatino (Fig. 2). La evaluación visual sugirió una reducción débil densidad microvascular y la apoptosis de bajo nivel por ABT-510 a una dosis baja elegida y por tipo metronómica dosificación de Cytoxan y cisplatino en el modelo de Matrigel de la angiogénesis. Sin embargo, la combinación de estos tratamientos causó un aumento sustancial en la apoptosis de células endoteliales y una dramática reducción de la densidad microvascular (Fig. 2A). El análisis cuantitativo mostró una tendencia a la disminución de la densidad microvascular por Cytoxan a las 2 ó 20 mg / kg / día en un ensayo de 7 días, que no alcanzó significación estadística (p 0,0004). El cisplatino por sí mismo, a 4 mg / kg redujo la densidad microvascular por el factor de 1,7 (P 0,01), mientras que se combina con ABT-510, causó una disminución más sustancial 2,8 veces en la densidad microvascular (P 0.05). análisis de isobolograma Limited mostró actividad antiangiogénica sinérgica entre ABT-510 y cytoxan a 2 mg / kg, mientras que 20 mg / kg Cytoxan y 0,4 mg / kg de cisplatino no excedieron aditivo. quimioterapia de dosis baja aumentó la muerte celular endotelial debido al ABT-510 a través del mecanismo de CD95-dependiente. A . ratones recibieron s. c. tapones de Matrigel y tratados con los compuestos que se indican (CTX-Cytoxan, CDDP cisplatino, rejilla). Los tapones se seccionaron, estructuras endoteliales visualizados por tinción fluorescente CD31 (rojo) y apoptosis detectada por desoxinucleotidil terminal de transferasemediated fin de etiquetado nick (verde). Nota aumento de células endoteliales apoptóticas por los tratamientos combinados. B. quimioterapia de dosis baja aumentada angiosuppression por ABT-510. Los ratones que llevan tapones de Matrigel angiogénicos fueron tratados como se indica. En el punto final, los tapones se procesaron como en (A) y la densidad microvascular (MVD) cuantificó usando software LasePix (Bio-Rad). DISCOS COMPACTOS . reducción de la angiogénesis se debió a los ratones de la apoptosis CD95 dependiente llevan tapones 1Matrigel suplementado con factor de crecimiento endotelial vascular y la heparina fueron tratados con la combinación de ABT-510 y Cytoxan (CTX 1 mg / kg ip y 2 mg / kg por vía oral, respectivamente), solo o en combinación con Fas-Fc receptor señuelo, un anticuerpo neutralizante contra CD36, un receptor de ABT-510, o un anticuerpo de control de isotipo IgA. Los tapones se procesaron como en (A) la angiogénesis (C) y la apoptosis (D) cuantificado como anteriormente. Tenga en cuenta la inversión de antiangiogénico y la apoptosis por el anticuerpo CD36 o por Fas señuelo. Sinérgico efecto antiangiogénico de ABT-510 y Cytoxan de dosis baja era concomitante con la inducción de la apoptosis (Fig. 2C-D). Tanto la apoptosis y la antiangiogénesis por Cytoxan / ABT-510 combinación fueron críticamente dependiente de la señalización de CD95. Cuando receptor señuelo Fas-Fc soluble se incorporó en los tapones de Matrigel, abolió completamente la reducción de la densidad microvascular por la combinación ABT-510 / Cytoxan y bloqueó la apoptosis de células endoteliales in vivo (Fig. 2C-D). La neutralización de anticuerpos contra CD36, un receptor antiangiogénico trombospondina-1, también abolió el efecto de ABT-510 y de la combinación de ABT / Cytoxan, señalando un requisito para el aumento de CD36 dependiente de CD95L (Fig. 2C-D). En la expresión de CD95 in vitro e impulsado-ABT-510 apoptosis de células endoteliales estaban directamente proporcional a la concentración Cytoxan (Fig. 1A y D). Por lo tanto, la apoptosis de células endoteliales menos pronunciada en respuesta a una dosificación Cytoxan superior era sorprendente. Sin embargo, 4-hidroperoxi-cytoxan a dosis de 10 mol / L directamente induce apoptosis de células endoteliales con una cinética más rápida que ABT-510. 5 inicio más temprano de la apoptosis in vivo debido a la dosis más alta Cytoxan puede ser seguido por la autofagia de células endoteliales, lo que podría dificultar nuestra capacidad para la detección. ABT-510 y Cytoxan metronómica cooperativamente bloquean el crecimiento del tumor. A continuación, prueba la capacidad de los agentes inductores de CD95 a cooperar con ABT-510 en el bloqueo del crecimiento tumoral mediante el modelo de ratón singénico y xenoinjertos de tumores en ratones inmunodeficientes. Debido Cytoxan y ABT-510 mostraron sinergia, en contraste con cisplatino cuyo efecto era meramente aditivo, nos centramos en la Cytoxan combinación / ABT-510. El crecimiento de carcinoma de pulmón de Lewis singénicas no se vio afectada por el solitario ABT-510 a 1 mg / kg o por cytoxan a 2 mg / kg. Combinados, ABT-510 y Cytoxan causaron una débil aunque disminución significativa en el volumen del tumor carcinoma de pulmón de Lewis (Fig. 3A P 0,05). la reducción del crecimiento similares se podría lograr con una dosis extremadamente alta de ABT-510 solo (240 mg / kg dos veces los datos no presentados). El crecimiento de carcinoma PC-3 de próstata injertado a los ratones deficientes inmune (nu / nu) se retrasó moderadamente (30) por tanto ABT-510 y cytoxan a 1 y 20 mg / kg, respectivamente, mientras que la terapia combinada provocó un retraso significativo de 60 (Fig. 3B P 0,04). El tratamiento combinado con la dosis baja de ABT-510 y Cytoxan metronómica causó la estabilización de los tumores establecidos. Si se iniciaron tratamientos idénticos cuando los tumores alcanzaron un volumen mínimo de 250 mm 3. aquellos en los grupos tratados con compuestos solitarios creció más o menos a las tasas similares a las del grupo de control. Por el contrario, los tumores en el grupo tratado con ABT-510 de combinación / Cytoxan se mantuvo estable (75 menor que en el grupo control. Fig 3C P 0,02). ABT-510 y la quimioterapia metronómica cooperativamente bloquean el crecimiento tumoral en el modelo de ratón. ratones C57BL6 se les dio carcinoma de pulmón de Lewis singénico (LLC). Células PC-3 de carcinoma de próstata fueron injertados a ratones inmunodeficientes (nu / nu. Jackson Labs, Harlan, o Taconics). Los animales fueron tratados con las combinaciones indicadas de ABT-510, Cytoxan metronómica (CTX) o vehículo control. Las flechas negras al comienzo del tratamiento. A . leve disminución en el crecimiento de s. c. carcinoma de pulmón de Lewis por combinación ABT-510-Cytoxan. Cytoxan se dio en 2 mg / kg por vía oral, ABT-510 a 1 mg / kg i. p. B. combinación ABT-510-Cytoxan tenía mayor efecto sobre la progresión de PC-3 tumores en los flancos. ABT fue dado en 1 mg / kg, cytoxan a 2 mg / kg. C. combinación ABT-510-cytoxan a las mismas dosis retrasa el crecimiento de tumores establecidos. D. terapia combinada con dosis más altas de ABT-510 (60 mg / kg, i. p.) y Cytoxan (20 mg / kg) causó retrasos prolongados en la progresión tumoral. Nota modesto efecto de ABT-510 a alta dosis y un aumento sinérgico en la respuesta del tumor a Cytoxan en presencia de ABT-510. Para mostrar claramente la sinergia entre ABT-510 y Cytoxan, se utilizó un estudio del tumor a corto plazo con dosis subóptimas de ambos antiangiogénico ABT-510 y de la quimioterapia metronómica Cytoxan (véase más arriba), que son mínimamente eficaces como compuestos solitarios. Posteriormente, para determinar el efecto de esta combinación sinérgica en el crecimiento a largo plazo de tumores PC-3 de xenoinjerto, se utilizó la dosis determinaron como la máxima eficacia en estudios anteriores (6. 8. 10), ABT-510 a 60 mg / kg / d y cytoxan a 20 mg / kg / d (Fig. 3D). El tratamiento se inició el día 29, después de que los tumores se volvieron palpables (100 a 150 mm 3). Solitary ABT-510 causó el retraso en el crecimiento del tumor que apenas era significativa (P 0,04 por semana de tratamiento 7). Cytoxan a 20 mg / kg produjo un retraso sustancial progresión 7-semanas en comparación con el control simulado tratados y un retraso de 6 semanas en comparación con ABT-510 (P 0,02). Es importante destacar que, combinado ABT-510 y Cytoxan produjo un efecto muy por encima de aditivo y retrasos progresión extendidos a por lo menos 11 semanas. el volumen del tumor Además, mientras que la reducción en el tamaño del tumor en un grupo que recibió solitario ABT-510 fue insignificante (P 0,76) y solo Cytoxan reduce el volumen del tumor en un 75 al 80 (P 0,001), la adición de ABT-510 al tratamiento metronómica Cytoxan reducirá en más 2,8 veces (P 0,03) que causa una disminución total 12,6 veces. Durante las primeras 4 semanas de tratamiento, los ratones tratados con Cytoxan metronómica, ABT-510, ABT-510 y Cytoxan continuaron ganando peso de manera similar al grupo de control. Después de día 28, los animales tratados con regímenes que contienen Cytoxan mostraron un aumento de peso ligeramente más lento que los grupos tratados con ABT-510 o vehículo control, probablemente debido al brazo Cytoxan del tratamiento. No hay pérdida de peso abierta se observó durante el período de tratamiento a largo plazo que sugiere leve o ningún efecto tóxico (datos no mostrados). ABT-510 / Cytoxan combinación sinérgicamente el aumento de la apoptosis en el endotelio asociado al tumor y microvasculatura borrado. Se comparó la densidad microvascular y la apoptosis de células endoteliales entre los grupos de tratamiento distintos (Fig. 4A-C). El análisis cuantitativo de los datos se resumen en la Tabla 1. En todos los modelos de tumores, tanto Cytoxan y ABT-510 indujo cantidad significativa de la apoptosis y la reducción de la densidad microvascular tumoral. Sin embargo, la acción acumulativa de la combinación Cytoxan / ABT excedió mucho efecto aditivo simple, como se determinó utilizando el producto fraccional de cálculos Webb (18). Las dosis bajas de ABT-510 y de Cytoxan fueron moderadamente sinérgica, mientras que óptima, superior muestran una fuerte sinergia en modelos de xenoinjertos PC-3 (E OBS 0,01). Curiosamente, aumento de la apoptosis y una disminución más fuerte en la densidad microvascular coincidió con la expresión concomitante de CD95 / CD95L por la vasculatura del tumor (Fig. 4D). El tratamiento combinado con anti-angiogénico ABT-510 y Cytoxan metronómica (CTX) trabajó en sinergia para bloquear la angiogénesis y para inducir la apoptosis. Los tumores de los experimentos de la Fig. 3 se congelaron, se seccionaron, se tiñeron para CD31, la apoptosis detectada por in situ terminal de desoxinucleotidil transferasemediated nick fin de etiquetado, y obtuvieron imágenes confocal y cuantificaron utilizando el software LaserPix. A . densidad microvascular (MVD, izquierda) y la apoptosis (a la derecha) en tumores en los flancos carcinoma de pulmón de Lewis (LLC). El tratamiento se indica a continuación. B. la densidad microvascular (izquierda) y la apoptosis (derecha) en PC-3 tumores tratados con dosis bajas de ABT-510 y Cytoxan. C. la densidad microvascular (izquierda) y la apoptosis (derecha) en PC-3 tumores tratados con altas dosis de ABT-510 y Cytoxan metronómica. D. disminución de la densidad de microvasos y la apoptosis en correlación con el aumento de expresión de CD95 y CD95L. Cryosections de los tumores de los ratones tratados como se indica (izquierda) fueron teñidos para CD31 (rojo), CD95 (azul), y CD95L (verde). Nota más alta de CD95 en los tumores tratados con Cytoxan-CD95L y el aumento en los tumores tratados con ABT-510. El análisis cuantitativo y estadístico de los tratamientos de complementación Discusión El concepto de dosis bajas de quimioterapia metronómica como un tratamiento antiangiogénico desarrollado rápidamente de modelos preclínicos en la evaluación de ensayos clínicos (12). Ofrece una alternativa prometedora a los regímenes de quimioterapia convencionales MTD más tóxicos. Alternativamente, breve tratamiento inicial con regímenes MTD seguido de regímenes metronómicos a largo plazo es una gran promesa cuando se trata de tumores voluminosos, que muestran mayor respuesta a la terapia MTD (20). La adición de medicamentos contra el cáncer dirigidos, especialmente los inhibidores de la angiogénesis, a la quimioterapia metronómica para el tratamiento de combinación crónica es otro medio prometedor para el desarrollo (12. 20. 21). Un número de estudios preclínicos han implicado el bloqueo de la angiogénesis en los efectos antitumorales de la quimioterapia metronómica (12. 22), donde la orientación de la creciente neovasculatura condujo a un efecto antitumoral secundaria. Hay tres conocidos no mutuamente exclusivos mecanismos subyacentes efecto antiangiogénico de la quimioterapia metronómica (12). El primero es mediante la inducción directa de la apoptosis de presumiblemente la proliferación de endotelio tumoral (21. 22), el segundo es a través de bloqueo de la movilización o la reducción del número de células progenitoras endoteliales circulantes viables que contribuyen a la neovasculatura del tumor (10. 11). El tercer mecanismo opera mediante la elevación de los niveles de la celular y en circulación inhibidor de la angiogénesis, trombospondina-1 a través de pasos desconocidos (5. 6). El aumento de la trombospondina-1 y no muerte directa por los fármacos de quimioterapia citotóxicos puede ser también responsable de la apoptosis de las células endoteliales completamente diferenciadas debido a la quimioterapia metronómica, así como la supresión de la CEP. De hecho, trombospondina-1 péptido mimético de ABT-510 suprime los niveles de PAC incluso en ratones tratados con el fármaco (10). Trombospondina-1 también reduce el número de la CEP, cuya incorporación en los vasos de remodelación proporciona un componente necesario de la angiogénesis tumoral (6. 10). Por lo tanto, el desarrollo de estrategias destinadas a incrementar la apoptosis de las células endoteliales (y posiblemente del CPA) por la quimioterapia metronómica, especialmente aquellos que explotan trombospondina-1 asume una alta prioridad. Hemos ideado una estrategia de complementación en la que la capacidad de trombospondina-1 para apuntar tumor se ve reforzada por la sensibilización adicional de las células endoteliales. En este péptido antiangiogénico enfoque específico, ABT-510 fue complementado por un régimen de quimioterapia metronómica que aumenta CD95, la limitante de la velocidad intermedia de la de los padres trombospondina-1, cuyo efecto es imitado por ABT-510 (23). Además de adriamicina, se identificaron dos agentes más, Cytoxan y cisplatino, que aumentaron endotelial CD95 asociado a células y aumentada significativamente, antiangiogenenic y efectos antitumorales apoptóticas por el ABT-510. En un ensayo a corto plazo, la combinación de ABT-510 y Cytoxan metronómicos mostró sinergia definitiva en el retraso de la progresión del tumor y estabilizar el crecimiento de tumores establecidos. En un ensayo prolongado, la dosis más alta de la ABT-510 tenía sólo un efecto modesto pero era fuertemente sinérgica con el tratamiento Cytoxan metronómica. Este efecto antitumoral sinérgico se asoció con una disminución de la angiogénesis y el aumento de la apoptosis del endotelio del tumor, lo que coincidió con niveles elevados de forma concomitante CD95 y CD95L proapoptótico. Nuestro objetivo inmediato fue establecer la prueba de principio para las terapias de complementación y para proporcionar material de partida para su posterior análisis y optimización de los tratamientos de combinación. El retraso en la tumor puede ser visto como un modelo para probar tratamientos destinados a controlar metástasis latentes, para los que el tratamiento crónico sería deseable. Debido a que en un tratamiento crónico efectos tóxicos se acumulan con el tiempo, se utilizaron dosis efectivas mínimas de tanto agente antiangiogénico y quimioterapia. En un modelo más aguda de tumor establecido, hemos probado las dos dosis de Cytoxan inferiores y superiores. Es importante señalar que la trombospondina-1 no es el único agente que utiliza cascada CD95 en matar endotelio activado. factor de epitelio derivado de pigmento, una proteína antiangiogénica potente también hasta regula CD95L como una parte de la señal de antiangiogénico (9). Recientemente, otros dos inhibidores naturales, Canstatin y angiostatina, también se han mostrado que depender, al menos en parte, sobre la apoptosis mediada por CD95 (24. 25). Puede ser que la razón del éxito en la combinación de agentes antiangiogénicos tales como trombospondina-1, la angiostatina, o un fragmento no catalítico de la metaloproteinasa de matriz 2 denomina PEX con carboplatino metronómica o etopósido (26) se encuentra en los elevados niveles de expresión de CD95 inducida por agentes quimioterapéuticos, que complementan los eventos moleculares angioinhibitory. Hay otros posibles beneficios adicionales en la combinación de fármacos antiangiogénicos si la quimioterapia metronómica. Por ejemplo, uno de ellos, la reducción de la presión oncótica debido a la normalización de la vasculatura del tumor, mejora la administración de fármacos quimioterapéuticos a las células tumorales disminuyendo de este modo al menos un posible componente de la resistencia intrínseca del tumor a la quimioterapia (27). Por otro lado, CD95 expresión por las células tumorales observadas en nuestro estudio puede contribuir a la destrucción de células tumorales por fratricida debido a la expresión ABT-510 dependiente de CD95L por la vasculatura del tumor. Las dosis acumuladas durante la quimioterapia metronómica es significativamente menor que en el régimen correspondiente MTD y del mismo modo son los efectos tóxicos asociados (28). Del mismo modo, la toxicidad asociada con el uso de los inhibidores naturales (endógenas) la angiogénesis observado durante los ensayos clínicos se observó como muy modesto (4). Por lo tanto, las terapias de combinación basados ​​en el uso de inhibidores de la angiogénesis de origen natural y la quimioterapia son prometedoras metronómica considerable y no sólo como tratamiento eficaz, pero sobre todo como una estrategia anticancerígena relativamente no tóxico contribuyendo así a mejorar la calidad de vida de los pacientes con cáncer que reciben los agentes de quimioterapia. Damos las gracias a Yelena Mirochnik y Thomas Nelius útil para los debates y conocimientos técnicos.